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癌症目的基因及其作用 根据作用机制可以将基因治疗的目的基因分为以下两大类： (一)调节机体免疫系统 由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能既源于肿瘤细胞本身的免疫原性不强(如MHC表达不足)，也可源于抗原递呈细胞(antigenpresentingcells，APC)不能提供足够的共刺激信号(如D7)，或者机体免疫因子分泌不是，或肿瘤细胞诱导机体的免疫抑制。因此，可以将某些细胞因子(如IL-2，IL-4，IL-1，IL-6，IL-7，IL-12，INF-γ，TNF-a，G-CSF，GM-CSF等)的基因转染到机体免疫细胞(如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞)中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实质上是免疫治疗加上基因转染技术。TIL具有在体内定位于肿瘤局部的能力，在体经转染目的基因(如IL-2、TNF)后，能高度表达各种免疫因子，再将这些细胞回输患者，可以期望TIL能集中于肿瘤并形成局部高免疫因子的环境，从而提高TIL对肿瘤细胞的杀伤活性。也可以将这些细胞因子基因转染到某些易于体内移植并能长期存活的细胞如成纤维细胞，使其在体内大量表达并长期发挥作用。此外，还可将这些细胞因子基因在体外转染至肿瘤细胞，经照射后再输回体内；或者将IL-2病毒载体或IL-2质粒DNA与脂质体复合物直接注射入肿瘤内。树突状细胞是肿瘤免疫治疗领域近年来引起重视的研究方向，特别是在体外经过基因修饰和肿瘤RNA刺激的树突状细胞，肿瘤特异性免疫能力大大增强，在小鼠模型上可以明显地抑制肺转移和延长生存时间。不过，这些各种各样的肿瘤免疫加基因治疗的方法虽然在理论上对刺激机体系统或局部肿瘤免疫功能有一定效果，但在实践中的临床疗效并不肯定，还有待进一步研究加以改善。 另一方面，由于肿瘤细胞存在功能性MHC I类抗原和(或)共刺激信号表达不足，也可以将一些与免疫识别有关的基因(如HLA、B7等)转染至体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者；或者将表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应。不过，由于免疫反应是由一个非常复杂的分子网络来调节，转染一二个基因可能难以激活机体对肿瘤的免疫反应。 值得一提的是，近年随着DNA疫苗的发展和一些肿瘤特异抗原的发现，肿瘤疫苗又激起许多研究者的兴趣。最早的研究证实在大鼠的腹腔注射DNA可以在肝脏中检出该DNA编码抗原的表达。而近年发现在肌肉内注射质粒DNA，可以激发机体对编码抗原的免疫反应，这自然为肿瘤疫苗开辟了一条新的路子。问题是如何获得只表达于肿瘤细胞的特异抗原。癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)和前列腺特异抗原(prostate-specificantigen，PSA)是已经发现的两种肿瘤细胞相关抗原，这类抗原的数量正在不断增加。Rosenberg等就利用表达黑色素瘤相关抗原MART-1和gpl00的腺病毒载体来治疗已发生转移的黑色素瘤患者，有个别患者获得完全缓解。此外，从理论上讲，在肿瘤细胞中突变率很高的一些癌基因和抑癌基因如Ras、p53、Rb等，它们的蛋白质结构的变异，可形成肿瘤细胞特有的抗原决定簇，而可以把这些突变的基因制成DNA疫苗。到目前为止，已有不少肿瘤DNA疫苗在动物模型上成功试验的报道，但要成功用于临床还有许多问题有待解决。比如是否在一个肿瘤的所有细胞中都表达肿瘤特异抗原，否则DNA疫苗只能抑制特异抗原阳性的细胞，阴性的肿瘤细胞反而获得选择性生长。另外，向体内注射只是部分突变的DNA，是否会诱发机体抗DNA抗体也值得予以考虑。当然，最重要的问题还是肿瘤患者所存在的系统性免疫耐受能否被一两个抗原所打破。 (二)肿瘤细胞与正常细胞差异表达基因 1．抑癌基因基因治疗 相比于正常细胞，肿瘤细胞的生长和增殖能力明显增强；而这种生长表型又是基于基因水平的抑癌基因失活和(或)癌基因的过度激活。对于癌基因的过度活化，可以用反义核苷酸技术或核酶(ribozyme)来进行阻断。抑癌基因则具有负性调控细胞生长和增殖的作用，当因突变或缺失而丧失功能时可促进细胞的生长和增殖。按Knudson的“二次打击”学说”，抑癌基因一个位点的先天变异加上另一个位点后天发生的突变或缺失，可以解释一部分肿瘤发生的机制。显然，肿瘤的发生发展往往是一个多基因参与、多步骤形成的过程，但在这种过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起了关键性作用，而抑制癌基因功能或恢复抑癌基因功能均可抑制肿瘤的生长。因此，可以将具有正常功能的野生型抑癌基因(如p53、p16、Rb等)通过各种途径转染至肿瘤细胞中，重建失活的抑癌基因功能，恢复细胞的正常生长表型，或者诱导细胞凋亡，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。在目前已经发现的抑癌基因中，p53是研究和应用得最多的一个。p53在人类肿瘤中突变率很高，平均达到50％～60％。野生型p53在体外细胞株和动物模型实验中均表现出很强的抑制细胞生长和诱导细胞凋亡的活性。有关p53的临床试验也在肿瘤基因治疗中占了很大比例，最有影响的是Roth等于1996年报道的用载有野生型p53的重组逆转录病毒进行的人体肺癌的实验治疗”。他们没有发现与病毒载体相关的明显毒性反应，而p53蛋白的表达和细胞凋亡的诱导在注射局部肿瘤组织中均得到证实。总共9例常规疗法失败的非小细胞肺癌中，有3例肿瘤体积明显缩小，另外3例停止生长。后来进一步扩大试验规模到28个病例，在可评价的25例中部分缓解的占8％，病情稳定的占64％，28％无效。除了肿瘤局部直接注射给药外，还可以采用经肝动脉插管灌注或腹腔注射，还可以配合放射治疗或与化疗药物同时使用，以增强肿瘤细胞对放射治疗和化疗药物的敏感性。 在抑癌基因基因治疗中，除了p53外，p21、p16、p27、Rb、BRCAl等均具有抑制细胞生长的能力，尽管在体外实验中，其能力远弱于p53。p16能阻抑细胞生长于G1—S期但并不诱发细胞凋亡；在头颈部肿瘤裸鼠移植瘤模型中，能显著地抑制肿瘤的生长。Rb基因也是一个细胞周期的负性调控因子，它在多数小细胞肺癌中均有突变。将Rb质粒DNA与脂质体复合物注射到接种小细胞肺癌细胞的有免疫功能的Beige-SCID鼠静脉中，发现Rb基因的表达确能抑制肿瘤细胞的生长，延长荷瘤鼠生存时间；静脉注射脂质体包裹的RbcDNA对RB基因Knockout(杂合子)所引起的垂体瘤肺转移也具有明确的抑制作用。BRCAl本是家族性乳腺癌和卵巢癌的遗传易感基因，具有上调p21表达、抑制DNA合成的能力。最近，Tait等利用逆转录病毒表达BRCAl经腹腔注射进行复发性上皮型卵巢癌临床I期试验，结果部分病例出现短期内消失的发热和无菌性腹腔炎，12个病例中有8例得以稳定。 抑癌基因由于其在肿瘤发生发展中的重要作用及其在人类肿瘤中检出的高突变率，自然成为基因治疗首先考虑的目的基因，特别是具有强烈的诱发细胞凋亡的p53。但目前进行的临床试验多选用常规疗法失败的晚期肿瘤患者，难以准确地评价出疗效，因为肿瘤发展到晚期，染色体发生了大量变异，机体的免疫系统也非常虚弱。因而，有必要在进行后期临床试验时适当地扩大选择病例的范围，以得出对抑癌基因基因治疗疗效的客观判断。 2．ElB缺陷的腺病毒基因治疗 p53是肿瘤细胞中突变率最高的一个抑癌基因。正是由于p53的突变和其功能的丧失，使DNA复制的忠实性得不到保证，也使正常的细胞凋亡受到影响，促进了肿瘤的发生和发展。利用肿瘤细胞和正常细胞中p53有无突变的差别，以ElB缺陷的腺病毒转染肿瘤组织，由于病毒的大量繁殖导致肿瘤细胞裂解死亡；而在有p53功能的正常细胞中，病毒繁殖力低下，毒性很小，从而达到选择性杀伤肿瘤细胞的目的。 E1A和ElB是腺病毒表达的两个早期蛋白，E1A可与Rb、p300等细胞内蛋白相互结合而阻断其功能，使细胞进入DNA复制期，快速繁殖，以利于病毒基因组复制。而EB则具有与p53蛋白相结合并抑制其功能的能力，使细胞丧失p53功能而不断分裂繁殖，产生大量病毒。因此，当ElB缺陷的腺病毒感染到p53功能正常的细胞时，p53能发挥“基因卫士”的作用，阻止细胞无限分裂繁殖，病毒的繁殖自然受到抑制，病毒对细胞的毒性作用也较小。而当这种病毒感染到p53突变的癌细胞时，由于没有p53的监控，细胞分裂活跃，病毒也大量繁殖，并最终使细胞破裂死亡。这种方法巧妙地利用了肿瘤细胞中大多丧失p53功能的特点，在动物肿瘤模型中取得了非常好的治疗效果，局部注射使60％的裸鼠移植瘤获得了完全消退，其余也有明显缩小。人体工期临床试验时，每天瘤体内注射4×109～5×1010PFU，连续5天为一个疗程，未见明显毒副作用；而所选择的14例常规疗法失败的头颈部癌患者中，有6例肿瘤明显缩小，还有部分病例病情改善。当然，其确切的疗效还有待Ⅱ、Ⅲ期临床试验的结果。不过，Hay等通过比较ElB缺陷的腺病毒在含野生型或突变型p53的肺癌细胞株中的复制能力，发现p53的状态并不是决定病毒复制能力的主要因素，可能ElB除了抑制p53外，还有其它的功能，值得进一步深入研究。 对于ElB缺陷的腺病毒的应用，要十分慎重，严格掌握好给药剂量，因为这种ElB缺陷的腺病毒还具有自主复制能力，在肿瘤细胞中大量复制的病毒在细胞破裂释放出来之后，除了可以再攻击其它肿瘤细胞之外，还可以经血液循环扩散至全身，产生毒性反应。因此，在应用E1B缺陷型腺病毒进行肿瘤基因治疗时，除了要考虑选择p53突变的肿瘤外，还要充分注意到这种病毒所具有的复制能力和对机体的毒性作用。 3．抗血管生成基因治疗 实体肿瘤细胞有别于正常组织的另一个特点是其生长有赖于新生血管的形成。因此，Folkman等于近年发展的血管生成抑制剂Angiostatin和Endostatin在动物模型上取得成功后，引起广泛的重视和兴趣。然而，长期而系统地给予蛋白质药物对局部快速生长的恶性肿瘤不一定是最佳的方式。基于此，有人试图将基因治疗的载体给药技术与血管生成抑制剂结合起来，利用重组逆转录病毒或腺病毒载体表达Angiostatin或EndostatincDNA。结果证明，在体外可以抑制血管内皮细胞的生长，在裸鼠移植瘤模型上可以阻抑肿瘤血管的形成，使肿瘤细胞因血供不足而发生凋亡，并最终导致肿瘤生长的抑制。Blezinger等则采用更简单的方法，即将Endostatin基因直接注射到小鼠肌肉中，结果证明Endostatin能产生并分泌到血液中，一次注射后能持续两周之久，并且能抑制原发肿瘤的生长和转移灶的形成。 基于肿瘤血供的原理，Lin等设计了能阻断Tie2受体的腺病毒载体。Tie2是血管内皮细胞特异的受体型酪氨酸磷酸化激酶，其活化在血管形成过程中有重要作用。利用能表达可溶性Tie2受体的重组腺病毒，可以特异地阻断肿瘤血管内皮细胞Tie2受体的活化，从而抑制血管的形成。在鼠乳腺癌和黑色素瘤模型上静脉注射腺病毒载体，发现的确可以显著控制肿瘤的生长，并且对手术切除后肿瘤的远处转移也有明显的效果。 4．“自杀”基因基因治疗 除了利用肿瘤细胞与正常细胞的天然差别进行基因治疗外还可以人为地改变肿瘤细胞的状态，如将“自杀”基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(herpessimplexvirusthymidinekinase，HSV-TK)转染至肿瘤组织，使肿瘤细胞成为有别于正常细胞、表达HSV-TK的细胞，能将前体药物Acyclovir(ACV)或Gancyclovir(GCV)转化为对分裂细胞具有杀伤作用的代谢产物，从而特异性地杀伤肿瘤细胞。 TK基因产物具有将一系列核苷酸类似物如ACV、GCV磷酸化的能力。在磷酸化后，ACV或GCV可以作为DNA合成的原料被DNA聚合酶掺入到DNA合成中，并使DNA链延长终止而导致细胞死亡。真核细胞在正常情况下不具有TK基因，所以ACV或GCV对正常细胞毒性很小。在动物模型上，经TK基因转染肿瘤细胞和静脉给予GCV成功地消除了肿瘤。在临床试验中，TK病毒载体最早被用于神经胶质瘤局部注射或手术切除后残留腔内注射，目前已进入临床Ⅲ期。 除了TK“自杀”基因外，胞苷脱氨酶(cytosinedeaminase，CD)也被用于基因治疗。CD基因存在于细菌和真菌，但在哺乳动物无此基因。CD基因产物可以使一系列嘧啶类似物如5-FC(5-fluorocytosine)脱氨基而变成具有细胞毒性的5-FU(5-fluorouracil)。相对于TK基因系统，CD基因有一大优点，就是人体可以耐受大剂量的5-FC而不产生明显毒副作用。此外，还有细胞色素P450，其表达在肝脏较高而在肿瘤组织缺如，通过转导P450至肿瘤细胞可以大大提高其对环磷酰胺类药物的敏感性。其它如XGPRT(xanthine-gua—ninephosphoribosyltransferase)和嘌呤核苷磷酸化酶(purinenucleosidephosphorylase，PNP)基因等也可用于“自杀”基因治疗。 对“自杀”基因基因治疗的作用机制，可能包括下述四种效应：①目的基因作用于前体药物所产生的产物对肿瘤细胞的杀伤作用；②旁观者效应(详见后述)；③注射鼠源细胞、病毒载体或其它复合物所引起的局部炎症反应；④系统性免疫反应。 5．“修饰”基因治疗 在肿瘤治疗中，还有一种方法是利用基因技术对正常细胞进行修饰，如将对化疗药物的多药耐药基因(multipledrugresistance，MDR)转染至肿瘤患者的造血干细胞，使其具有比肿瘤细胞更强的化疗药物耐受力，可以提高临床化疗剂量和时间，而减轻化疗最主要的副作用——对骨髓细胞的损害。骨髓移植的同时结合IL-2及IL-3基因转染的成纤维细胞的植入，则有可能进一步增加其抗肿瘤作用。此外，某些造血因子的基因，如GM-CSF导入造血干细胞也可以达到类似目的，但应注意高度表达的生长因子可能潜在的致癌作用。 |